Bakterilerden Gelen Umut: CRISPR-CaS9 ile Kanser Tedavisi

Bakterilerden bahsedildiğinde insanlar çoğunlukla zararlı olduklarını düşünür. Fakat bakteriler hayatımızın her yerindedir ve bize yardımcı olurlar. Örneğin, sütten yoğurt yapmak istediğimizde bakterileri kullanırız veya yemek yediğimizde bağırsaklarımıza yerleşmiş olan bakteriler sayesinde yiyecekleri sindiririz. Bu yazımda bakterilerin hayatımıza yeni bir açıdan dahil olmasını ele alacağım.

İngilizce olarak “Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats” olarak tanımlanan ve tam bir Türkçe karşılığı bulunmayan CRISPR-Cas, bakteri ve arkelerde bulunan, bağışıklıkta rol alan sistemlerdir¹. CRISPR-Cas sistemi, yabancı DNA’ları tanıyarak organizmayı işgalci virüsler ve plazmitlere karşı korur¹. Emmanuelle Charpentier ve Jennifer Doudna, 2012 yılında CRISPR-Cas9 olarak bilinen ve sadece tek bir proteine ihtiyaç duyan sistemin; gen kesmek, izole etmek ve düzenlemek için kullanışlı olduğunu keşfetti^1,2. Charpentier ve Doudna, basit şekliyle gen makası olarak tanımlayabileceğimiz bu buluş sayesinde 2020 yılında Nobel Kimya Ödülü’nü kazanmışlardır.

CRISPR-Cas9 sisteminde Cas9 bir nükleaz görevi görür ve CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive edici CRISPR RNA (transactivating CRISPR RNA – tracrRNA) şeklinde yönlendirici diziler kullanır^1,2. tracrRNA’nın rolü, DNA hedef bölgesini tanımak ve crRNA’yı hedef DNA’nın tamamlayıcı dizisi ile etkileşime yönlendirmektir¹. crRNA hedef DNA’daki dizi ile eşleştiğinde, Cas9 çift zincir kırığı oluşturur^1,2.

Genom düzenleme amacıyla, DNA üzerindeki hedef bölgeyi belirlemek ve Cas9’a bağlanmak için ikili tracrRNA-crRNA yerine tek bir yönlendirici RNA (single guide RNA-sgRNA) tasarlanmıştır^1,2. sgRNA, CRISPR-Cas9’u, protospacer bitişik motife (protospacer adjacent motif–PAM) yakın DNA üzerindeki herhangi bir diziyi hedefleyecek şekilde programlamak için kullanışlıdır. PAM’ın yokluğunda Cas9, gRNA hedef diziyle tamamen tamamlayıcı olsa bile hedefi tanıyamaz¹. PAM gereksinimleri hedefi sınırlar ve bu, CRISPR-Cas9 sisteminin dezavantajıdır³. Cas9 ile bağımsız olarak eşleşen birden çok gRNA, birden çok hedef bölgeyi mutasyona uğratmak için tek bir hücrede ifade edilebilir³.

Kullanım kolaylığının yanı sıra CRISPR-Cas9, kanser genomiklerinde etkili tarama sağlar ve kanser genomunda bulunan intronları incelemek için kullanılabilir⁴. CRISPR-Cas9, hedeflenen genin fenotip üzerindeki etkilerini belirlemek için gen nakavtında kullanılabilir⁴. Bu tarama ile temel genler belirlenebilir ve tedavi için hedeflenebilir⁴. Ayrıca, temel proteinler CRISPR-Cas9 aracılığıyla belirlenebilir ve ilaç keşfi için kullanılabilir⁴. Bunlara ek olarak, spesifik genlerin aşırı ekspresyonunun neden olduğu ilaç direnci, bu teknoloji ile tanımlanabilir⁴.

CRISPR-Cas9’un in vivo iletimi, plazmitin doğrudan enjeksiyonu veya elektroporasyonu yoluyla mümkündür ve klasik genetik yöntemlere kıyasla çalışmaları kolaylaştırır⁴. Adenovirüsler ve lentivirüsler, plazmidi in vivo hedeflenen dokulara aktarmak için de kullanılabilir⁴. In vivo çalışmalar kanserde genlerin rolünü anlamak için in vitro çalışmalardan daha iyidir çünkü kanser hastalarında büyüme rekabeti ve bağışıklık sistemi yanıtı sağlayabilir⁴.

Bağışıklık hedefli tedaviler T hücrelerine odaklanır ve iki yol izler: anti-tümör antikorları sağlayarak pasif immünoterapi ve kontrol noktası blokajı ile immün hücrelerin mobilizasyonuyla aktif immünoterapi⁵. T hücrelerini hedeflemek için kontrol noktası inhibitörleri, tasarlanmış T hücre transferi ve aşılama veya hücre içi mekanizmalar kullanılabilir⁵. Bağışıklık kontrol noktası blokajı, T hücresi işlevini engelleyen sinyalleri kaldırır⁵. Örneğin, programlanmış ölüm 1 (PD-1) reseptörleri, T hücrelerinde bulunur ve kanser hücreleri tarafından ifade edilen programlanmış ölüm ligandı 1 (PD-L1) molekülleri ile birleşebilir⁵. Bir kez devreye girdiklerinde, sinyal T hücresine negatif bir sinyal olarak iletilir, ölüm veya fonksiyon kaybı ile sonuçlanır⁵.

2020’de yayınlanan çalışmada, dirençli kansere sahip hastalarda alternatif bir immünoterapi yöntemi olarak görülen T hücrelerinin CRISPR-Cas9 ile düzenlenmesi ve kanser hastalarının bu terapiye yanıtı araştırıldı⁶. T hücrelerinin düzenlenmesi lentiviral transdüksiyonu sayesinde Cas9 ile gerçekleştirildi⁶. Bu düzenleme sırasında endojen T hücre reseptörünü (TCR) kodlayan iki gen (TCRα ve TCRβ) silinerek, TCR’nin yanlış eşlenmesini azaltmak ve sentetik, kansere özgü olan, humoral ve hücresel yanıtı artırabilen TCR transgeninin (NY-ESO-1) ekspresyonunun arttırılması hedeflendi⁶. Antitümör bağışıklığı geliştirmek için üçüncü bir gen olarak PD-1 kodlayan gen uzaklaştırıldı⁶. Bu çalışma için uygun görülen üç hastadan T hücreleri toplandı, Cas9 ile değiştirildi ve elde edilen sentetik hücreler infüzyonla hastalara verildi⁶. İnfüzyon sonrasında sentetik T hücrelerinin dokuz aya kadar istikrarlı şekilde kalıcı olduğu gözlemlendi⁶.

Kanser immünoterapilerinde yaygın bir sorun olarak görülen sitokin salınım sendromunun Cas9 ile tasarlanmış sentetik T hücrelerinde oluşmadığı gözlemlendi⁶. Cas9’a karşı önceden var olan bağışıklık tepkileri nedeniyle düzenlenmiş hücrelerin reddi gözlemlenmedi⁶. Herhangi kesin bir tedavi yanıtı elde edilmemesine karşın, CRISPR-Cas9 ile düzenlenen hücrelerin toksik bir etkisi olmadığı kanıtlanarak Cas9 ile geliştirilen immünoterapilerin güvenilirliği ve uygulanabilirliği gösterildi⁶. Fakat kesin olarak Cas9’un güvenilir olduğu kanısına varabilmek için daha fazla hasta sayısına ve daha uzun süreli gözlemlere ihtiyaç duyulmaktadır⁶.

Kaynaklar:

1. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829
2. Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science (80- ). 2014;346(6213). doi:10.1126/science.1258096
3. Malzahn A, Lowder L, Qi Y. Plant genome editing with TALEN and CRISPR. Cell Biosci. 2017;7(1). doi:10.1186/s13578-017-0148-4
4. Zhan T, Rindtorff N, Betge J, Ebert MP, Boutros M. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy. Seminars in Cancer Biology.doi:10.1016/j.semcancer.2018.04.001
5. Palucka AK, Coussens LM. The Basis of Oncoimmunology. Cell 164(6). 2016; 1233-1247.doi:10.1016/j.cell.2016.01.049
6. Stadtmauer EA, Fraietta JA, Davis MM, Cohen AD, Weber KL, Lancaster E, Mangan PA, Kulikovskaya I, Gupta M, Chen F, Tian L, Gonzalez VE, Xu J, Jung IY, Melenhorst JJ, Plesa G, Shea J, Matlawski T, Cervini A, Gaymon AL, Desjardins S, Lamontagne A, Salas-Mckee J, Fesnak A, Siegel DL, Levine BL, Jadlowsky JK, Young RM, Chew A, Hwang WT, Hexner EO, Carreno BM, Nobles CL, Bushman FD, Parker KR, Qi Y, Satpathy AT, Chang HY, Zhao Y, Lacey SF, June CH. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 2020 Feb 28;367(6481):eaba7365. doi: 10.1126/science.aba7365.

Görsel Kaynaklar:

1. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829

Denetleyen: Beril GÜREL