Yaşamın hiç duraksamadan sürdüğü bu dünyada, gelişen bilim sayesinde her gün yeni keşifler yapılmakta. Bu gelişime ayak uyduramayanlar geri kalırken, ayak uydurabilenler her geçen gün katkıda bulunarak yeni yaklaşımlar ortaya koymaktadır. Günümüzde genetik, genetik mühendisliği ve sentetik biyoloji alanlarında yaşanan hızlı gelişmeler sayesinde, mikroorganizmaların istenilen biyolojik işlevleri yerine getirecek şekilde yeniden dizayn edilmesi ile mümkün hale gelmiştir. Bu bağlamda, CRISPR, TALEN, ZFN ve meganükleazlar gibi öne çıkan gen düzenleme yöntemleri, modern biyoteknolojide yaygın olarak kullanılmaktadır.
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
CRISPR teknolojisi, özellikle gün geçtikçe devrim yaratan bir gen düzenleme tekniği olarak dikkat çekmektedir. CRISPR sisteminin temel prensibi, bakterilerin virüslere karşı geliştirdiği bağışıklık mekanizmasına dayanır. Virüsler bakterilere genetik materyallerini aktardıktan sonra, bakterinin bağışıklık sistemi bu materyalle savaşır. Mücadelenin sonunda, virüsün genetik materyalinin bir bölümü alınarak “spacer” adı verilen özel bölgede saklanır. Bu sayede bakteri, CRISPR hafızasını oluşturur. Aynı virüs tekrar saldırdığında, bakteri bu genetik bilgiyi tanır, eşleştirir ve hızlı bir şekilde savunma tepkisi verir. CRISPR/CAS tekniğinde ise; hedef DNA dizilerini yönlendirebilen, kısa rehber RNA’lar (‘single guide RNA’, ’guide RNA’ ya da kısaca ‘sgRNA’, gRNA’) ile cas enzimlerinden oluşan bir kompleks şeklinde çalışır. Tekniğin en çok kullanılan enzimi CAS9 endonükleazıdır. CRISPR RNA (crRNA), tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA) ve cas9 birleşerek kompleks oluşturur. Birleşmiş kompleks yapı cas9 enzimini aktive eder. Aktif cas9, crRNA öncülüğünde rehber RNA’nın belirlediği hedef DNA’yı tanıyarak çift zincirli DNA’yı keser. Bu mekanizma gen silme işlemlerinde kullanılırken cas9 enziminin gen silme özelliği ortadan kaldırılır ise dead cas9 (dCas9) formuna ulaşır. dCAS9 formu kullanıldığında sistem sadece DNA’ya bağlanmış olur. Kesme işlemini yapamaz. Ancak bağlandığı için orada çalışmakta olan RNA polimeraz enziminin fiziksel geçişini engeller yani çalışmasını durdurur. Sonuç olarak o genin transkripsiyonu baskılanmış olur. Bu da hedef genin ifadesinin kontrollü bir şekilde azaltılmış olmasını sağlar. Bu yöntem hayati genlerde çalışırken fazlasıyla avantaj sağlar çünkü, hayati genlerin tamamen silinmesi hücrenin yaşamına son verebilir. Fakat bu yöntem yani gen ifadesinin susturulması, diğer adıyla gen baskılama, gereken durumlarda indüklenerek tersine çevrilebilir. Bu şekilde sürekli kontrollerle gerektiği müddetçe canlılığa zarar vermeden hedef sistemin oluşturulmasına olanak tanır. Gen silme işlemi daha sert, yavaş ve geri döndürülememe ihtimali sebebiyle, gen baskılama geçici genetik düzenlemelerde tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir [1, 2, 3 , 4].
TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases)
TALEN’ler, Xanthomonas bakterisinin bitki hücrelerinde gen ifadesini düzenlemek için kullandığı TALE proteinlerinden türetilmiştir [2]. TALE modülleri, hedef DNA’nın nükleotidi tanıyan aminoasit çiftlerinden oluşmaktadır ve bu modüller DNA’nın istenilen kısmının nükleotid sırasına uygun şekilde dizilerek birbirlerine bağlanırlar. TALE modüllerinin birbirine bağlanmasının ardından, Fokl endonükleaz enzimi de bu diziye katılır ve bir kompleks oluştururlar. Fokl endonükleaz, inaktif yapıya sahip DNA’yı kesme görevi olan bir enzimdir. İki ayrı TALEN proteinleri hedef DNAnın karşılıklı zincirlerine bağlanmasının ardından, Fokl enzimleri karşılıklı gelince inaktif halden aktif hale geçerler. Aktifleşen Fokl enzimleri DNA’nın çift zincirinde kırıklar oluşturarak gen silme işlemini gerçekleştirirler [2, 3, 4, 5].
ZFN (Zinc Finger Nucleases)
ZFN’ler, eukaryotik transkripsiyon faktörlerinden türetilen çinko parmak (zinc finger) proteinlerinden oluşur. Zinc finger modülleri TALEN’e çok benzer işleve sahiptir fakat her nükleotide karşılık bir protein değil, her 3 nükleotitte bir zinc finger protein dizisi oluşturur. Bu proteinlerin ardışık olarak dizilmesinin ardından diziye Fokl enzimi katılır. İki fokl enzimi karşılıklı dimerleşerek aktifleşince DNA’nın çift sarmalında kesme işlemini gerçekleştirirler [2, 3, 4].
Meganükleazlar
Meganükleazlar hem doğal hem de sentetik endonükleazlardır. Hedef DNA dizisini başka bir yardıma ihtiyaç duymadan tanıyıp, doğrudan kesme işlemini yapabilirler [4].
TALEN, ZFN ve Meganükleazlar, gen düzenleme alanında uzun yıllar boyunca önemli rol oynamış; hedef DNA’ya spesifik olarak bağlanıp çift sarmallı kesikler oluşturarak genetik manipülasyonlara olanak tanımıştır. Ancak, CRISPR-Cas sistemlerinin ortaya çıkışıyla birlikte bu teknikler daha az tercih edilmeye başlanmıştır. Bunun temel nedeni, CRISPR-Cas sistemlerinin gen düzenleme sürecini çok daha kolay, hızlı ve maliyet etkin hale getirmiş olmasıdır. TALEN ve ZFN gibi yöntemlerde her hedef DNA dizisi için özel proteinler geliştirilmesi gerekirken, CRISPR teknolojisinde yalnızca hedefe özgü kısa bir rehber RNA molekülü tasarlanması yeterlidir. Bu basitlik ve esneklik, CRISPR teknolojisinin kısa sürede yaygın olarak benimsenmesini sağlamıştır.
Sonuç olarak, sentetik biyoloji alanında bu gen düzenleme teknikleri kullanılarak hücre içindeki metabolik sistemler yeniden şekillendirilebilmektedir. Bazı metabolik yollar yavaşlatılırken, diğerlerinin aktivitesi artırılabilir. Bu sayede, hücrenin enerji kaynaklarını hangi süreçlerde kullanacağı yönlendirilebilir veya belirli bir yapı taşından türetilen ürünlerin verimi artırılıp azaltılabilir. Böylece, hücresel işleyiş üzerinde hassas kontrol sağlanarak biyoteknolojik üretim süreçleri optimize edilebilmektedir.
Kaynakça
[1] Karlson, C. K. S., Mohd-Noor, S. N., Nolte, N., & Tan, B. C. (2021). CRISPR/dCas9-based systems: mechanisms and applications in plant sciences. Plants, 10(10), 2055.
[2] Brocken, D. J., Tark-Dame, M., & Dame, R. T. (2018). dCas9: a versatile tool for epigenome editing. Current issues in molecular biology, 26(1), 15-32.
[3] Gaj, T., Gersbach, C. A., & Barbas, C. F. (2013). ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology, 31(7), 397-405.
[4] Tufan, F. (2019). Genom düzenleme teknolojileri ve bitkilerdeki uygulamaları. Haliç Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 2(1), 113-133.
[5] Becker, S., & Boch, J. (2021). TALE and TALEN genome editing technologies. Gene and Genome Editing, 2, 100007.
Görsel Kaynakça
Görsel I CanvaAI tarasından oluşturulmuştur.
Görsel II, III, ve IV Tufan, F. (2019). Genom düzenleme teknolojileri ve bitkilerdeki uygulamaları. Haliç Üniversitesi Fen Bilimleri Dergisi, 2(1), 113-133. Makalesinden alınmıştır.
Denetmen: Elif DÖNMEZ
